2024-08-07
在探索生命奧秘的征途中，DNA作為遺傳信息的載體，其完整性與準確性對于解析物種的遺傳信息、進化歷程、生理特性和疾病機制具有不可估量的價值。高通量測序技術，作為現代生物學的銳利工具，為我們提供了前所未有的視角，深入剖析DNA的微妙變異與復雜調控。基因組Denovo、群體進化、GWAS性狀定位、WGS、WES測序等，每一項技術都是解開生命密碼的關鍵鑰匙。
然而，這一切探索的基石，在于高質量DNA樣本的獲取與妥善管理。樣本的采集、運輸與保存，每一個環節都如同精密儀器中的齒輪，緊密相連，共同確保遺傳信息的完整無損。為了助力科研工作者在探索之路上行穩致遠，我們精心整理了一套基因組研究樣本寄送的標準化流程及注意事項，旨在為您的研究之旅保駕護航。
1、動植物樣本
植物樣本 | |||
測序平臺 | 最少送樣量 | 建議送樣量 | 樣本保存與運輸 |
二代測序 | 嫩葉鮮重0.5g | 嫩葉鮮重1.5g | 二代和三代測序樣本：建議收集于Axygen 1.5/2.0ml管中，或選用密封性更好的2.0ml螺紋凍存管；2.Hi-C和超長ONT樣本：推薦使用 50ml離心管；3.全長轉錄組：取樣后迅速放入預冷好的已寫好編號的 RNase-free的螺紋凍存管中。樣本收集后液氮速凍15min，-80℃冰箱保存； 干冰運輸。 |
三代測序(Pacbio Revio) | 嫩葉鮮重5g | 嫩葉鮮重10g | |
Hi-C測序 | 嫩葉鮮重2g (0.5g/管) | 嫩葉鮮重2g (0.5g/管) | |
超長ONT測序 | 嫩葉鮮重2g (0.5g/管) | 嫩葉鮮重2g (0.5g/管) | |
全長轉錄組 | 嫩莖、嫩葉鮮重 0.5g，根、花、果實、種子等 0.8-1g | 嫩莖、嫩葉鮮重 0.5g，根、花、果實、種子等 0.8-1g | |
樣本準備方法 | |||
樣本收集 | 二代和三代取樣：選取新鮮的組織部位樣本，在活體狀態下擦凈組織表面灰塵和雜質，保留完整葉柄，每份樣本 0.5g(2×2cm2)左右，每個樣品 2-3 份（其它部位應適當增加取樣量）； Hi-C和超長ONT取樣：先觀察，用手觸摸，選取頂部剛長出的觸感柔軟的小嫩葉。注意：選材時需要組織幼嫩，葉片小不等于嫩，嫩葉的觸感和老葉有明顯不同。 全長轉錄組取樣：選取新鮮的組織部位樣本，在活體狀態下擦凈組織表面灰塵和雜質，隨后取樣。 | ||
注意事項 | 1. 失綠、衰老嚴重、干燥樣本提取成功率會很低； 2. 樣本不建議使用硅膠干燥保存，會影響DNA質量； 3. 葉綠體項目，送樣量請加倍。 | ||
動物樣本 | |||
測序平臺 | 最少送樣量 | 建議送樣量 | 樣本保存與運輸 |
二代測序 | 肌肉組織鮮重 0.3g血液樣本（哺乳動物1mL；非哺乳動物0.5mL） | 肌肉組織鮮重 0.6g血液樣本（哺乳動物3mL；非哺乳動物1.5mL） | 樣本收集后液氮速凍15min，-80℃冰箱保存；干冰運輸。 |
三代測序(Pacbio Revio) | 肌肉組織鮮重 5g血液樣本（哺乳動物10mL；非哺乳動物5mL） | 肌肉組織鮮重 10g血液樣本（哺乳動物10mL以上；非哺乳動物5mL） | |
Hi-C測序 | 軟組織（肝，脾，腎等）2g以上；纖維組織（肌肉）2~5g | 軟組織（肝，脾，腎等）2g以上；纖維組織（肌肉）2~5g | |
超長ONT測序 | 軟組織（肝，脾，腎等）2g以上；纖維組織（肌肉）2~5g | 軟組織（肝，脾，腎等）2g以上；纖維組織（肌肉）2~5g | |
全長轉錄組 | 每個部位組織鮮重0.5g | 每個部位組織鮮重0.5g | |
樣本準備方法 | |||
樣本收集 | 肌肉組織樣本：取肌肉組織（推薦），每份鮮重 0.3-0.5g(一個黃豆大小，非肌肉組織建議適當增加送樣量)左右，組織離體后需快速用 PBS 沖洗掉其他多余殘留組織，用吸水紙去除多余的液體，組織離體后需快速清洗，立即裝入2 mL離心管； 血液樣本：采集新鮮血液 2-3mL于抗凝管中（推薦使用 EDTA 抗凝管（紫色蓋子采血管）），立即充分混勻樣本。由于會影響提取效果，不能使用肝素抗凝（綠色、棕色蓋子采血管）。 全長轉錄組取樣：快速從動物活體取材獲得 0.5g 組織后，快速用預冷的RNase free 水進行漂洗，以去除血漬和污物，并剔除非研究組織。將采取的組織迅速放入預冷的 RNase-free 帶螺旋帽的 1.5 mL 或 2.0 mL 的 EP 管/凍存管中。 | ||
注意事項 | 1.不建議使用無水乙醇、福爾馬林等保存樣本，會影響DNA質量； 2.Hi-C測序推薦使用組織樣本，血液樣本提取細胞核時未做研磨處理，可能有一部分還是細胞狀態，而在酶切連接時，細胞內容物中的一些雜質影響了酶的活性，導致樣本酶切連接效率較低； | ||
昆蟲樣本 | |||
測序平臺 | 最少送樣量 | 建議送樣量 | 樣本保存與運輸 |
二代測序 | 中大型昆蟲（體長 5mm，體寬 3mm 以上）0.3g；微體型昆蟲（蚜蟲、飛虱類等）0.3g | 中大型昆蟲（體長 5mm，體寬 3mm 以上）0.9g；微體型昆蟲（蚜蟲、飛虱類等）0.9g; | 樣本收集后液氮速凍15min，-80℃冰箱保存； 干冰運輸。 |
三代測序(Pacbio Revio) | 中大型昆蟲（體長 5mm，體寬 3mm 以上）3g；微體型昆蟲（蚜蟲、飛虱類等）2g | 中大型昆蟲（體長 5mm，體寬 3mm 以上）6g；微體型昆蟲（蚜蟲、飛虱類等）4g | |
Hi-C測序 | 送樣前提前需提前溝通 | ||
超長ONT測序 | 送樣前提前需提前溝通 | ||
全長轉錄組 | 每個部位組織鮮重0.5g | 每個部位組織鮮重0.5g | |
樣本準備方法 | |||
樣本收集 | 中大型昆蟲：若為野生昆蟲，最好活體狀態下用 75%乙醇漂洗昆蟲外表進行消毒殺菌處理，隨后取肌肉組織或頭部（避開昆蟲腸道，以避免腸道微生物的污染，或整只昆蟲直接放入離心管內）； 微體型昆蟲：建議取活昆蟲（如蚜蟲，20只以上，0.2-0.5g 左右），放入 2 mL 離心管。 全長轉錄組取樣：快速從動物活體取材獲得 0.5g 組織后，快速用預冷的RNase free 水進行漂洗，以去除污物，并剔除非研究組織。將采取的組織迅速放入預冷的 RNase-free 帶螺旋帽的 1.5 mL 或 2.0 mL 的 EP 管/凍存管中。 | ||
注意事項 | 1.不建議使用無水乙醇、福爾馬林等保存樣本，會影響DNA質量； 2.大型昆蟲建議去除腹部腸道污染，微體型昆蟲建議饑餓處理，排除腸道微生物污染再送樣。 | ||
2、微生物樣本
微生物樣本實驗室不接收液體樣本，液體樣本在處理過程中會造成氣溶膠污染，導致整個實驗室環境污染，進而影響所有老師項目。樣本較少、菌液樣本、培養基殘留過多、樣本水分大等情況，嚴重影響提取效率。液體樣本、樣本量不滿足送樣要求的，實驗室會直接拒收。
細菌樣本 | |||
種類 | 最少送樣量 （二代/三代） | 建議送樣量 （二代/三代） | 樣本保存與運輸 |
細菌 G- | 菌體濕重 0.1g/0.5g | 菌體濕重 0.3g/1.0g | 菌體建議收集于Axygen1.5/2.0ml管中，或選用密封性更好的2.0ml螺紋凍存管。樣本收集后液氮速凍15min，-80℃冰箱保存；干冰運輸。 |
細菌 G+ | 菌體濕重 0.3g/0.7g | 菌體濕重 0.5g/1.4g | |
樣本準備方法 | |||
樣本收集 | 菌體培養：至對數期的菌體，OD600值介于0.4-0.8之間(不同菌種達到對數期時的OD值可能有差異)，如果是多糖或次生代謝物較多的菌體，OD600值介于0.4-0.6之間。 菌體收集：在 4℃條件下，轉速低于 10000g/min，離心時間低于 10min；菌體不能有培養基殘留，離心后倒干凈培養基，如還有殘留，可短暫離心后(幾秒鐘即可) 用移液槍吸取干凈；加入適量 1x PBS 緩沖液（Ambion，貨號:AM9624），上下輕柔顛倒使菌體散開（勿劇烈震蕩），離心收集菌體，轉速低于 10000rpm/min，離心時間低于 10min。 | ||
注意事項 | 1. 請勿用甘油菌直接復蘇后搖菌收集菌體進行后續實驗，請嚴格挑選單克隆搖菌； 2. 細菌樣本建議使用液體培養基搖瓶培養； 3. 培養基需澄清透明(類似于 LB 培養基，YPD 培養基等)，不含不溶成分如：不溶淀粉、谷粉、不溶鹽類、顆粒懸浮雜質等。不建議使用血培養基。 | ||
真菌樣本 | |||
種類 | 最少送樣量 | 建議送樣量 | 樣本保存與運輸 |
二代測序 | 菌體濕重 0.3g | 菌體濕重 0.5g | 菌絲體建議收集于Axygen 1.5/2.0ml管中，或選用密封性更好的2.0ml螺紋凍存管。樣本收集后液氮速凍15min，-80℃冰箱保存； 干冰運輸。 |
三代測序(Pacbio Revio) | 菌體濕重1g | 菌體濕重3g | |
Hi-C測序 | 菌體濕重2g | 菌體濕重4g | |
超長ONT測序 | 菌體濕重3g | 菌體濕重6g | |
樣本準備方法 | |||
樣本收集 | 建議使用液體培養基搖菌培養，待長成1-3mm的小顆粒后，取適量菌液于 15或 50ml 離心管中，5000rpm/min離心5 min收集菌體（若菌量較少，可多次離心富集或過濾收集），加入適量1x PBS緩沖液（Ambion，貨號:AM9624）沖洗多余的培養基，將收集到的菌體置于無塵紙上輕輕擠壓去除水分，隨后將樣本收集到無菌的 1.5ml 離心管中。 | ||
注意事項 | 1. 不建議使用野外采集的大型真菌，可能會有內生菌共生菌等污染； 2.培養菌體的時間不宜過長，一般培養至對數生長中期時收集菌體，不能存在明顯的胞外多糖等分泌物，如果菌體的生長速率較慢，建議采用大量接種的方法縮短培養時間。 | ||
病毒樣本 | |
樣本收集 | （1）RNA病毒需要反轉錄成單鏈cDNA或者雙鏈cDNA（推薦送雙鏈cDNA）才能送樣，公司不做反轉錄這一步； （2）文庫類型怎么選擇？老師送單鏈cDNA——單鏈cDNA文庫，雙鏈cDNA——雙鏈cDNA文庫，雙鏈DNA病毒——PE文庫。 |
注意事項 | 公司不接收病毒原樣，只接收核酸樣本。 |
3、醫療樣本
醫療樣本 | |||
測序平臺 | WGS\WES最少送樣量 | WGS\WES建議送樣量 | 樣本保存與運輸 |
人組織樣本 | 手術新鮮組織黃豆大小2-3塊; 穿刺組織長度至少1cm 2-3條; | 組織樣本、細胞樣本、唾液樣本：樣本收集后液氮速凍15min，-80℃冰箱保存，干冰運輸； 血液樣本：保存在-20°C冰箱，冰袋運輸； FFPE類樣本：室溫儲存及運輸。 | |
細胞樣本 | 細胞數量級大于 107 | ||
血液樣本 | 1ml | 3ml | |
唾液樣本 | 1ml | 3ml | |
FFPE 類樣本 | 石蠟塊：2年以內標準程序制備的石蠟塊，蠟塊中組織體積大于1cm3。 石蠟組織切片：2年以內標準程序制備的石蠟組織切片，未染色的白片，厚度：5-10μm，表面積大于1cm2，10 片及以上（如切片厚度或表面積達不到要求需按比例增加切片數量）。 | ||
樣本準備方法 | |||
樣本收集 | 細胞樣本：選取生長狀態良好的細胞樣本，細胞數量級大于107，200g離心5min，去上清；加入適量1xPBS清洗細胞，200g離心5min，去上清，清洗2次，-80℃保存，干冰運輸； 血液樣本：采集新鮮血液 2-3mL于抗凝管中（推薦使用 EDTA 抗凝管（紫色蓋子采血管）），立即充分混勻樣本。由于會影響提取效果，不能使用肝素抗凝（綠色、棕色蓋子采血管）。 唾液樣本：收集唾液樣本前的 15 分鐘內，請勿進食、吸煙、嚼口香糖和飲水。在收集唾液樣本前，請用飲用水將口腔內的雜物洗漱干凈（注：為保證收集的唾液中富有足夠量的細胞，建議漱口時間為收集唾液樣本的前 30 分鐘）。確認唾液采集管的外包裝完好； | ||
注意事項 | FFPE 樣品提取的質量取決于固定和包埋過程的處理，樣本如果未處理好，會造成核酸嚴重片段化； | ||
4、核酸樣本
DNA 樣品送樣要求：
1.DNA 樣本需主帶清晰，無雜質。
2.樣本體積不少于 15μL，必須用 1.5ml 或 2.0ml 離心管裝載核酸樣品；為防止樣品管破裂、污染或混亂等，請不要使用諸如 PCR 管、0.5ml EP 管、八聯管、96 孔板、深孔板等非標準管送樣。
3.避免紫外照射，不可反復凍融，不可存放于高溫狀態，不可存放于極端PH溶液中（PH<6 或 PH>9）。
4.樣品溶液澄清無色，無不可溶解物質，無 RNA 污染。
5.樣品 A260/280=1.8~2.0，A260/230≥2，樣品 NanoDrop 所測濃度與 Qubit 所測濃度比值（簡稱 Na/Qu）低于 1.2。
二代測序核酸要求 | ||||
編號 | 文庫類型 | 樣本/組織類型 | 最低濃度要求 (ng/μl) | 單次建庫總量要 求(μg) |
1 | Pair-end | 常規PE文庫 | 1 | 0.05 |
微量PE文庫 | 0.5 | 0.005 | ||
2 | dd-RAD | dd-RAD文庫 | 12 | 0.5 |
3 | 全外顯子 | 全外顯子文庫 | 5 | 0.5 |
4 | PCR-free | PCR-free文庫 | 10 | 1 |
5 | cDNA | 雙鏈cDNA文庫 | 2 | 0.2 |
單鏈cDNA文庫 | 2 | 0.2 | ||
6 | SSR | SSR文庫 | 5 | 0.5 |
7 | 擴增子 | 擴增子文庫 | 1 | 0.015 |
三代核酸送樣要求 | |||
測序平臺 | 物種 | 文庫個數 | DNA用量 |
Pacbio Revio | 動植物、微生物 | 1 | 10ug（純化后） |
PromethION | 動植物基因組 | 1 | 10ug（純化后） |
真菌基因組 | 1 | 3ug（純化后） | |
細菌基因組 | 1 | 3ug（純化后） | |
注：
1）具有致病性及傳染性的 DNA 病毒類樣本請在訂單中標明；
2）如果DNA溶液中存在雜質，實驗室會進行磁珠純化提高純度，根據 DNA 溶液的純凈度會有20-80%的損耗，DNA 里面雜質越多損耗越大，總量是否合格需根據純化后的結果判定。
